摘要：【目的】夏季高温可导致牡丹Paeoniasuffruticosa生长受限，花期缩短，观赏品质降低。研究牡丹耐热基因对牡丹热胁迫的分子机制。【方法】以牡丹品种‘羽红’‘Yuhong’为材料，对高温(40℃)和对照(25℃)处理后的叶片进行转录组测序，分析响应高温表达的差异基因;同时利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)验证差异基因，并对热激蛋白基因HSPs进行时空表达分析。【结果】测序共获得45.97Gb数据，与对照组(25℃)相比，高温处理后4220个基因上调表达，3453个基因下调表达。通过基因本体(GO)分析发现，这些差异基因主要富集于代谢等生物学过程、细胞和膜结构等细胞成分以及结合和催化活性等分子功能条目;另外，通过全基因组及代谢途径数据库(KEGG)分析发现，碳代谢途径的差异基因数量最多。对牡丹热激蛋白PsHSP基因定量分析发现，PsHSP基因随着高温处理时间呈上升表达趋势，24h达到最高，之后便呈现下降趋势。【结论】高温显著影响牡丹的代谢和合成等过程，进而影响牡丹的生长和发育。PsHSP基因可在短期内迅速响应高温胁迫并参与牡丹的耐热调控。图4表6参34
关键词：植物学;牡丹;高温胁迫;转录组;HSP
全球变暖导致植物在生长发育和环境适应性等方面面临更加多样化的挑战[1]。高温不仅影响植物表型变化，而且会引起植物体内细胞稳态失衡，生长和发育受到抑制，严重影响观赏植物的品质和产量[2−3]。如芍药Paeonialactiflora在遭受高温胁迫后，植株出现萎蔫、畸形、变色等热害现象，甚至全株死亡。在牡丹P.suffruticosa中也出现类似的表型现象[4−5]。另外，经过高温处理后，牡丹和月季Rosachinensis体内的脯氨酸、丙二醛、可溶性糖以及相对细胞膜透性显著升高，而净光合速率、超氧化物歧化酶和可溶性蛋白质含量等显著降低[6−8]。为了深入了解高温胁迫对观赏植物品质的影响，利用现代分子生物学以及转录组学等手段[9]，挖掘关键基因并解析其调控耐热的分子机制，是培育和开发耐热优良品种的重要途径。对非洲菊Gerberajamesonii切花高温处理后，转录组分析发现大部分单基因簇(unigenes)可注释到细胞过程、代谢过程和结合功能等基因本体(GO)过程中[10];全基因组及代谢途径数据库(KEGG)中代谢功能途径中的单基因簇分布最多。在柳枝稷Panicumvirgatum中发现[11]：长期热胁迫条件下大量的基因发生差异表达，其中与ATP酶调节因子、伴侣结合和蛋白质折叠相关的基因显著上调，与蛋白质修饰、转录、磷和氮代谢途径相关的基因在热胁迫后显著下调。热激蛋白(heatshockprotein,HSPs)是一类高温胁迫诱导的主要功能蛋白，其分子量为10~200kDa，包括HSP60、HSP70、HSP90、HSP100和小分子量热激蛋白[12](smallheatshockprotein，sHSP)5类。HSPs充当蛋白质质量控制的分子伴侣，作为分子伴侣和折叠催化剂细胞网络的中心成分，在热应激中被诱导并参与热应激过程中的信号转导[13];sHSP存在多数植物叶肉细胞中，在外界热诱导条件下的sHSP表达呈现上升的趋势[14−16]。在女萎Clematisapiifolia[17]中，高温处理后热激蛋白热胁迫后明显上调，而且sHSPs是对热胁迫反应最强烈的伴侣基因家族。HSPs不仅响应高温变化，还对水分、盐渗透和氧化胁迫等[12,14]有响应。牡丹是芍药科Paeoniaceae芍药属Paeonia多年生落叶灌木，中国传统名花[18]。目前，关于牡丹基因的研究多集中于生长发育、花色基因挖掘以及抗氧化活性物质生物合成等方面[19−22]，相关耐热研究报道较少。牡丹对高温较为敏感，夏季高温严重制约牡丹的生长和发育，致使花期缩短，观赏品质降低，因此，挖掘牡丹耐热基因对牡丹热胁迫分子机制探究，以及牡丹育种和推广具有重要的意义。
1材料与方法
1.1植物材料
实验材料牡丹‘羽红’P.suffruticosa‘Yuhong’保存在浙江农林大学智能实验大棚。取长势一致的1年生幼苗移栽至花盆缓苗，1株·盆−1，正常管理。后转移至人工气候箱中，在温度25℃，光12h/暗12h，光强4000lx，湿度80%条件下预培养2周。处理组和对照组分别置于40和25℃人工气候箱中处理24h，选取相同位置的叶片，使用液氮速冻并保存于−80℃冰箱于后期备用，设置3个生物学重复。
1.2叶片总RNA提取及cDNA文库构建
使用Trizol试剂盒(天根，北京)提取牡丹叶片总RNA，按照说明书操作。用紫外分光光度计和质量分数1.5%琼脂糖凝胶电泳检查RNA质量，质量检测合格后，经百迈客生物科技有限公司(北京)使用IlluminaHiSeq2500对6个独立样品进行双端文库构建以及RNA-Seq测序。
1.3转录组测序及数据分析
将测序获得的原始序列读长(rawdata)进行过滤组装，得到高质量的有效序列读长(cleanreads)，然后使用Trinity进行序列组装[23−24]。所得单基因簇序列用基于BLAST算法的搜索和注释，对照非冗余蛋白质(Nr)数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov/)、全基因组及代谢途径(KEGG)数据库(www.genome.jp/kegg/kaas/)、蛋白直系同源簇(COG)数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/)以及瑞士蛋白质序列及注解(Swissprot)数据库(www.expasy.ch/SPORT)等数据库进行注释。使用Blast2Go软件(www.blast2go.com/)进行基因本体论(GO)功能分析。
1.4基因表达量及差异基因分析
使用Bowtie软件将测序所得的片段与非冗余基因序列库进行对比，结合RSEM(RNA-SeqbyExpectation-Maximization)预估表达量水平[24−25]。在此基础上分析高温胁迫处理前后6组样本的差异表达基因，使用RPKM[每百万序列读长(Reads)中某基因每千长度序列读长值]统计基因的表达量;单基因簇表达丰度用FPKM值表示，以差异倍数|log2A≥2[A表示差异倍数或变化倍数(flodchange)]，且错误发现率(falsediscoveryrate)≤0.01为标准筛选差异表达基因。
1.5实时荧光定量PCR
使用PrimerPremier5.0软件设计荧光定量PCR引物(表1)，PrimeScriptRTreagentKitWithgDNAEraser试剂盒(TaKaRa，北京)进行实时荧光定量PCR反应。反应体系：上下游引物(10μmol·L−1)各0.4μL，cDNA1.0μL，ddH2O3.2μL，SYBRPremixExTaq5.0μL。总反应程序：95℃预变性30s，95℃变性5s，60℃复性30s，共38个循环。以2−ΔΔCt法[26−28]计算目的基因相对表达量，其中以牡丹Ubiquitin为内参基因[29]，设3次生物学重复。
2结果与分析
2.1测序数据组装结果
对照组(ck1、ck2和ck3)与高温(40℃)处理组(TE1、TE2和TE3)样本经过测序后，获得45.97Gb的有效序列读长，且6个样品Q30碱基百分比值均大于等于96.71%(表2)。转录本序列数量(transcriptnumber)总计151939条，非冗余基因序列数量(unigenenumber)54935条，有较高的组装完整性。经拼接后片段重叠群N50长度为1561nt，平均长度为1042nt，长度为300~500nt的单基因簇数量占组装总量的36.1%，有19834条。长度500~1000nt的数量次之，占总量的28.94%。大于2000nt的占总量13.33%(图1)。
2.2转录组单基因簇的数据库功能注释
将单基因簇基因序列分别在各数据库注释，其中以非冗余蛋白质数据库(Nr)获得注释的比例最高，达到98.76%(表3)。
根据非冗余蛋白质数据库中的物种注释对比，做出对应注释图和E值分布图，大部分序列(29.13%)E值为0~10−150(图2A)，25.78%的序列相似度大于80.00%(图2B);另外，22.43%的单基因簇基因可注释到葡萄Vitisvinifera，6.56%的单基因簇序列可以注释到欧洲栓皮栎Quercussuber(图2C)。
2.3响应高温胁迫的差异基因功能富集分析
以差异倍数≥2和错误发现率≤0.01为标准，共筛选获得7673个差异基因，其中4220个基因上调表达，3453个基因下调表达。利用Web基因本体论注释软件进行基因本体富集分析(表4)，有6443个差异基因富集于生物过程，主要集中于代谢过程(1702个，占26.42%，GO：0008152)、细胞过程(1489个，占23.11%，GO：0009987)和单一生物过程(1148个，占17.82%，GO：0044699);有6491个差异基因富集于细胞成分，主要集中于细胞(1316个，占20.27%，GO：0005623)、细胞部分(1302个，占20.06%，GO：0044464)和膜结构(1232个，占18.98%，GO：0016020);有3812个差异基因富集于分子功能，主要分布在结合活性(1523个，占39.95%，GO：0005488)、催化活性(401个，占45.09%，GO：0003824)和转运活性(291个，占7.63%，GO：0005215)等过程。
将高温组(TE1、TE2、TE3)与对照组(ck1、ck2、ck3)相比，进行全基因组及代谢途径调控网络富集分析，共有949个差异基因(differentexpressiongeneset，DEGs)可注释到全基因组及代谢途径通路中(表5)。集中在碳代谢途径(carbonmetabolism)和内质网蛋白质加工(proteinprocessinginendoplasmicreticulum)的差异基因数量较多(99个和59个)，其次是苯丙烷类生物合成(phenylpropanoidbiosynthesis)和糖酵解糖异生途径(glycolysis/gluconeogenesis)。表明在高温刺激后，牡丹中的多种代谢途径、生物合成途径和内质网蛋白加工途径等均发生变化，积极参与应激响应。
2.4实时荧光定量分析
为了进一步验证转录组数据，随机选取10个上调和下调的差异基因，分别是热激蛋白70(PsHSP70，c65824.graph_c0)、核糖体蛋白S4(PsRPS4，c119988.graph_c0)、酸性黏多糖(PsAMP1，c120725.graph_c0)、肽基脯氨酰顺反异构酶(PsPPIL1，c111758.graph_c0)、4-香豆酸辅酶A连接酶(Ps4CL1，c114411.graph_c0)、阳离子氨基酸转运蛋白5(PsCAT5，c106006.graph_c0)、叶绿素酶(PsCHL1，c111201.graph_c0)、类胡萝卜素裂解双加氧酶(PsCCD4，c97637.graph_c0)、腺苷甲硫氨酸脱羧酶样原酶(PsSAMDC，C112526.graph_c0)以及假定蛋白(c120729.graph_c1)，使用qRT-PCR的方法进行验证分析(图3)，两者在变化趋势和差异倍数总体相符，表明测序结果相对可信。
2.5高温胁迫下牡丹‘羽红’热激蛋白HSP基因挖掘及表达分析
通过分析测序发现：17个热激蛋白基因在高温胁迫后显著上调表达(表6)，这些热激蛋白多定位在细胞核、线粒体、叶绿体和内质网等部位。选取6个PsHSP(PsHSP1、PsHSP2、PsHSP4、PsHSP5、PsHSP7、PsHSP11)分别在25和40℃处理下进行时空表达分析(图4)。在40℃高温处理下，6个PsHSP表达呈上升趋势，且全部于24h达到最大值，之后便呈现下降趋势;25℃条件下，6个PsHSP表达变化相对稳定。
3讨论
全球变暖使得世界上许多地区农业受到不同程度的热害影响。近年来，植物耐热性研究逐渐受到关注。短期或持续高温胁迫引起植物形态和生理生化方面的改变，影响植物生长发育的同时也导致农林经济产量下降[1,30−31]。高温是限制牡丹生长的重要因素且严重影响其观赏性。通过RNA-Seq测序发现：牡丹‘羽红’高温胁迫后共有7673个基因差异表达，这些差异基因在基因本体注释主要集中在代谢过程、细胞过程和单一生物过程;全基因组及代谢途径数据库富集分析发现：大部分DEGs富集在苯丙烷生物合成、蛋白质的合成途径;同时，碳代谢、碳固定、糖酵解/糖异生和丙酮酸代谢等途径均受到高温胁迫的影响。
极端温度可以造成植物体内蛋白质功能障碍导致生长发育受限，热激蛋白HSPs参与植物细胞膜稳定及相关代谢过程[12,30]，在响应和调节高温胁迫的过程中发挥重要作用[32−34]。芍药PlHSP70基因过表达拟南芥Arabidopsisthaliana发现，PlHSP70对拟南芥高温的耐受性有正向调节作用，高温处理后转基因株系的叶绿素荧光值明显高于野生型植株，此外还具有更加完整的细胞膜、叶绿体和淀粉颗粒。百合LiliumbrownieLlHSP70基因异源转化拟南芥，LlHSP70可以增强转基因植株的高温耐性;烟草NicotianatabacumClassⅠ类热激蛋白TLHS1基因在烟草幼苗中的表达水平与耐热性有较强的相关性，TLHS1转至烟草幼苗经过高温胁迫1~4h后，子叶开张率比转反义转基因烟草幼苗高出1倍以上。本研究发现：高温胁迫后，共有17个PsHSP基因在牡丹中上调表达，且PsHSP2、PsHSP4、PsHSP5、PsHSP7和PsHSP11在高温处理后表达上调3倍以上;同时PsHSPs时空表达也发现，PsHSP随热胁迫时间增加而表达量上升，24h后达到最大值后便逐渐下降，说明PsHSP基因可能在短期内迅速响应高温胁迫并参与牡丹的耐热调控。综上，通过转录组测序发现，高温显著影响牡丹的代谢和生物合成等过程，从而抑制牡丹的生长和发育。PsHSP基因可在短期内迅速响应高温胁迫并参与牡丹的耐热调控。本研究可为进一步探究牡丹耐高温胁迫的分子机制提供依据。——论文作者：郝力慧1,2,3，董彬1,2,3，朱绍华1,2,3，马进1,2,3
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