摘要：对采自青海玉树、青海果洛和云南迪庆的冬虫夏草鲜品进行虫生真菌的分离、纯化，获得3种生长形态不同的真菌QH2019、GL2019和YN2019。通过形态学及分子鉴定，菌株QH2019为蝙蝠蛾拟青霉Samsoniellahepiali，菌株GL2019为粉棒束孢Isariafarinosa，菌株YN2019为玫烟色棒束孢Isariafumosorosea。对这3株菌的培养条件初步研究，结果表明：菌株QH2019在1/4SDAY上菌丝日生长速率最快，为(1.94±0.55)mm/d，且菌丝致密、粗壮、含水量高达(91.90±1.22)%，虫草素和虫草酸均以PDA培养的含量最高，分别为：(0.47±0.022)mg/g和(3.24±0.021)mg/g;菌株GL2019在PDA上菌丝日生长速率、菌丝含水量和虫草素、虫草酸都最高，分别为(2.37±0.20)mm/d、(88.34±2.00)%、(0.23±0.013)mg/g和(6.92±0.019)mg/g，但其菌丝在1/4SDAY上生长最为致密、粗壮;菌株YN2019在PDA上菌丝日生长速率、虫草素和虫草酸的含量最高，分别为：(2.27±0.27)mm/d、(0.50±0.012)mg/g和(11.32±0.16)mg/g，但其菌丝在1/4SDAY上含水量最高(95.23±1.65)%，且生长最为致密、粗壮。综合评价表明三株真菌中YN2019菌丝中虫草素和虫草酸的含量高、生长速率快，有较好的药用研究价值。
关键词：虫生真菌，分离鉴定，生物学特性，发酵条件
冬虫夏草是由冬虫夏草菌Ophiocordycepssinensis(Berk.)G.H.Sungetal.侵染蝙蝠蛾幼虫所形成的子座和充满菌丝的幼虫复合体。近些年研究表明，冬虫夏草提取物和菌丝发酵液中主要的活性物质为虫草酸(钱正明等2019)、虫草素(胡敏和程震勇2019)、多糖(崔兵兵等2019)等;具有诱导凋亡和抗癌(Baietal.2020;Qietal.2020)、调节机体免疫和微生物群落(Jietal.2020;Yingetal.2020)、减压降脂抗糖尿(Lietal.2020)、抗菌消炎(Lietal.2020)、抗氧化延缓衰老(Wangetal.2005;Wuetal.2019)、镇静催眠和抗惊厥(丁婷等2008)、延缓神经元细胞衰老(Caoetal.2020)等作用。
在中国，冬虫夏草主要分布于西北西藏、青海、四川、云南3000–5000m的高原草甸地区(周刊社等2018;徐梦等2019)，由于生长环境与寄主的限制，天然冬虫夏草资源有限且呈下降趋势(杨大荣等1996)。因此，从上世纪80年代起，研究人员对新鲜的冬虫夏草的菌种分离、人工培养开发进行了大量的研究。已有多个独立实验证明中国被毛孢HirsutellasinensisX.J.Liuetal.是冬虫夏草菌的无性型，其发酵产物具有调节自身免疫(章水晶等2019)、护肾(沈龙海等2011)、抗氧化(丁婷等2007)等功效，被制成“百令”胶囊(洪露露2019);从云南迪庆冬虫夏草种分离出来的蝙蝠蛾拟青霉Samsoniellahepiali(Q.T.Chen&R.Q.DaiexR.Q.Daietal.)H.Yuetal.(Wangetal.2020)，其菌丝发酵产物与冬虫夏草有效成分相似(Jarmilaetal.2019)，已被开发成药物“金水宝”胶囊(赵小惠等2020)。
为了获得具有药用价值的冬虫夏草菌及其相关菌株，本研究拟从青海玉树、果洛和云南迪庆采集的新鲜冬虫夏草中分离纯化，并对纯化的菌株进行显微形态学和分子生物学的鉴定;选择有药用价值的菌株，探究其在不同的培养条件下对菌株生长和有效物质产量的影响，以期获得具有药用价值和人工培养前景的菌株资源。
1材料与方法
1.1材料来源
供试菌株从云南省迪庆市和青海省果洛市、玉树市采集的新鲜冬虫夏草样品中分离获得，现保存于西北农林科技大学植物保护学院昆虫与微生物资源利用实验室菌种库;样品采集于2019年5月至6月。
1.2方法
1.2.1培养基：1/4SDAY选择性培养基：酵母提取物2.5g，葡萄糖10.0g，蛋白胨2.5g，琼脂20.0g，水1000mL，121℃高压灭菌20min，备用;使用前加入氨苄西林钠0.5g和硫酸链霉素0.6g。马铃薯葡萄糖琼脂(potatodextroseagar，PDA)培养基：去皮马铃薯200g，水1000mL，煮沸15min，过滤，取上清定容至1000mL，再加入葡萄糖20.0g、琼脂20.0g，121℃高压灭菌20min，备用。查氏培养基(Czapek-doxmedium)：硝酸钠3.0g、磷酸二氢钾1.0g、七水合硫酸镁0.5g、氯化钾0.5g、硫酸亚铁0.01g、蔗糖30.0g、琼脂20.0g、水1000mL，121℃高压灭菌20min，备用。
1.2.2菌株的分离与纯化：将采集到的冬虫夏草新鲜样品用75%乙醇进行表面消毒，待表面干燥后用灭菌的手术刀切取0.5cm×0.5cm小块，接种在加入抗生素的1/4SDAY培养基上，15℃、避光培养7d;挑取菌落边缘，进行纯化培养。
1.2.3菌株的形态学观察：将分离、纯化的菌株接种于含1/4SDAY培养基的培养皿和200mL组织培养瓶(培养基30mL)中，将培养皿和组培瓶在15℃恒温生化箱遮光培养30d、60d，观察菌株培养皿和组培瓶中生长特征，主要包括菌落形态、菌丝颜色、渗出物颜色等。挑取少量菌丝，对菌株进行形态特征的显微观察，主要包括菌株的菌丝特征、产孢结构特征、孢子形态及大小等。参考《中国真菌志·第43卷》(梁宗琦等2013)中的检索表及各菌株的特征描述对分离获得的菌株进行初步鉴定。
1.2.4DNA提取、PCR扩增及测序：将分离获得的菌株接种于1/4SDAY培养皿上，15℃、培养14d，收集培养皿表面的菌丝，根据Masoudietal.(2018)方法进行菌丝总DNA的提取。
以提取的总DNA为模板，进行多基因引物扩增及测序，引物序列见表1。PCR反应体系(25μL)：ddH2O17.7µL，10×PCRReactionBuffer2.5µL，dNTPs(2.5mmol/L)2µL，正、反向引物(10μmol/L)各0.5µL，0.1%BSA0.3µL，Taq酶(5U/μL)0.5µL，DNA模板1µL。
ITS基因的PCR反应条件：95℃5min;95℃30s，60℃30s，72℃1min，35个循环;72℃10min。nrSSU基因的PCR反应条件：95℃4min;94℃50s，56℃50s，72℃2min，循环8次，每循环退火温度降低0.5℃;94℃50s，52℃50s，72℃2min，循环25次;72℃10min，12℃保存。TEF、RPB1、RPB2、nrLSU基因的PCR反应条件：95℃4min;94℃50s，56℃50s，72℃70s，循环8次，每循环退火温度降低0.5℃;94℃50s，52℃50s，72℃70s循环25次;72℃10min，12℃保存(段东娥2019)。用1%琼脂糖胶检测PCR扩增产物，将PCR未纯化产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。
1.2.5序列对比及系统发育分析：将测序结果在GenBank中进行同源序列比对;结合已报道的分离自冬虫夏草的菌株，并下载菌株的相关序列，用MEGA-X进行序列比对，在PhyloSuitev1.2.1中采用最大似然法(MaximumLikelihood，ML)，联合真菌ITS、nrSSU、nrLSU、TEF、RPB1、RPB2序列(表2)的构建系统发育树，确定分离菌株的种属地位。
1.2.6不同培养基对菌株生长速率的影响：将分离的菌株驯化培养，直至菌落为规则圆形、直径约为60.0mm时，用7.0mm打孔器沿菌落边缘打孔;再将菌碟分别接种于PDA、1/4SDAY和查氏培养基上，15℃恒温培养;每2d测量一次菌落直径(十字交叉法)[菌丝生长速度(mm/d)=菌落半径(mm)/菌丝生长天数(d)](Yinetal.2009)测量至14d，各株菌每种培养基重复三次。
1.2.7不同培养基对菌株的菌丝含水量的影响：收集各菌株同一培养基中菌丝，称量鲜重;55℃干燥至恒重、称量，计算菌丝含水率[菌丝含水率(%)=菌丝干重(g)/菌丝鲜重(g)×100]。
1.2.8不同培养基对菌株的虫草酸和虫草素含量的影响：将干燥的菌丝粉碎，精确称取0.5g，装入10mL离心管中，以液料比20:1加入超纯水，400W、10min、常温超声提取(唐果等2018)。将2.0μg/mL、5.0μg/mL、10.0μg/mL、20.0μg/mL、50.0μg/mL的标准品进行LC-MS检测;分别以虫草素和虫草酸浓度为横坐标，相应的峰面积为纵坐标建立标准曲线，并得出线性回归方程及R2。菌丝提取液上清过0.22μm微孔滤膜，进行LC-MS分析，根据标准曲线计算含量。
1.2.9菌丝提取物检测条件：采用LC-MS(液质联用)的方法对菌丝提取物中的虫草酸和虫草素含量进行检测，仪器为LTQXLmassspectrometer(ThermoScientific，Waltham，MA，USA);LC检测条件：色谱柱：XTerraMSC18Column(5μm，150mm×4.6mm;WatersCorp，Milford，MA，USA);梯度洗脱，流动相组成见表3;流速：0.5mL/min;MS检测条件：离子源：ESI(阳离子模式)，喷雾电压：4.5kV，毛细管温度：275°C，鞘气流速：20(arb)N2，虫草素和虫草酸的质谱条件见表4(张铭雅等2019)。
1.2.10统计学分析：本研究采用Excel软件进行数据整理，采用SPASS22.0软件进行统计处理，采用GraphPadPrism8系统制图。
2结果与分析
2.1三株菌的形态学鉴定
通过对新鲜冬虫夏草样品的分离、纯化，最终获得3株外观、形态均不相同的虫生真菌，分别命名为QH2019、GL2019、YN2019。
菌株QH2019是从青海省玉树市采集的新鲜冬虫夏草样品中分离、纯化，菌株在15℃培养30d，菌落直径为85.0–90.0mm，菌落正面中间呈浅黄色、周边为白色、隆起，菌丝绒毛状、致密;菌落背面中间呈黄色、周边为白色，具放射状沟纹(图1A、1D)。菌丝无色、有隔、分支，直径0.5–3.0μm;瓶梗(3.0–5.0μm)基部膨大呈椭圆形，单生或由2–4个瓶梗组成分支状分生孢子梗(5.0–10.0μm);分生孢子(2.0–2.5)×(1.0–1.5)μm，球形至卵圆形，无色，链生(图2A–2C)。在组织培养瓶中培养60d，菌株QH2019菌丝黄色、产生白色孢梗束(图3A、3E)，见光后菌丝逐渐变为橙黄色(图3B、F)。
菌株GL2019是从青海省果洛市采集的新鲜冬虫夏草样品中分离、纯化，菌株在15℃培养30d，菌落直径为85.0–90.0mm，菌落正面为均匀生长的白色、绒毛状菌丝，中间和边缘有孢梗束、白色至鸭黄色;菌落背面为白色、在菌源周围呈橙黄色(图1B、1E)。菌丝无色、分隔，直径0.7–2.5μm;分生孢子梗长(100–300μm)，从基质菌丝上生长，不规则分枝，上有2–4个瓶梗组成的轮生体，瓶梗(5.0−15.0)×(1.2−2.5)µm，基部膨大呈椭圆形、上端有明显变细的颈部;分生孢子(1.8−2.5)×(1.0−1.5)µm，球形至椭圆形，长链状(图2G–2I)。在组织培养瓶中培养60d，菌株GL2019菌丝白色、产生白色孢梗束，见光后不变色(图3D、3H)。
菌株YN2019是从云南省迪庆市采集的新鲜冬虫夏草样品中分离、纯化，菌株在15℃培养30d，菌落直径为80.0–85.0mm，菌落正面中央为白色、周围为肉红色，菌丝绒毛状、面附着有肉红色液滴状渗出物;菌落背面中间为黄色、周边为白色(图1C、1F)。菌丝无色、分隔，直径1.0–3.0μm;产孢结构复杂，分生孢子梗10.0–30.0μm，上有3–6个瓶梗组成的轮生体，瓶梗(2.5–4.0μm)基部显著膨大呈卵圆或椭圆形，向上有明显的细颈;分生孢子(3.0–3.5)×(1.0–2.0)μm，透明、光滑，梭形至椭圆，长链(图2G–2I)。在组织培养瓶中培养60d，菌株YN2019菌丝白色，上有均匀的肉红色、珊瑚状孢梗束，孢梗束上附着酒红色渗出物(图3D、3H)。
相关期刊推荐：《菌物学报》(双月刊)创刊于1982年，报道该领域的最新研究进展和具创造性或较高学术水平的论文和简报。已在国内外学术界享有较高的声誉，对繁荣和发展我国真菌科学并与国际接轨作出了积极贡献。设有：菌物系统分类学及菌物多样性、菌物资源开发利用、真菌生态及生物防治、菌物共生作用、真菌毒素、致病真菌、菌物学研究的新方法、新技术等栏目。
根据以上形态学观察结果和寄主种类，并结合《中国真菌志·第43卷》和Mongkolsamrit(2018)研究结果，初步鉴定菌株QH2019为蝙蝠蛾拟青霉Samsoniellahepiali;菌株GL2019为粉棒束孢Isariafarinosa(Holmsk.)Fr.，异命为粉拟青霉Paecilomycesfarinosa(Holmsk.exGray)A.H.S.Br.&G.Sm.(蒋毅和姚一建2003;代永东等2015);菌株YN2019为玫烟色棒束孢IsariafumosoroseaWize。
2.2两基因系统发育分析
以AschersoniaconfluenceBCC7961为外群建立系统发育树(图4)，结果显示：菌株QH2019与SamsoniellahepialidICMMCs-4聚类在同一个小分支上，相似性为98%;菌株GL2019与IsariafarinosaNHJ08013聚类在同一个分支上，相似性为97%;菌株YN2019与CordycepsfumosoroseaCBS107.10聚类在同一个分支上，相似性为97%。
2.3不同培养基对菌株生长的影响
对3株菌在不同培养基上生长的菌丝进行直径和菌落形态观察，测量和观察结果见表5、图5、图6。GL2019在3种培养基上均能正常生长，菌丝直径表现为：PDA>1/4SDAY>查氏培养基;菌株在PDA培养基上菌丝日生长速率最快，且与其他两种培养基差异显著，在1/4SDAY和查氏培养基上无显著差异。QH2019在3种培养基上均能正常生长，菌丝直径表现为：1/4SDAY>PDA>查氏培养基;菌株在1/4SDAY培养基上菌丝日生长速率最快，且与其他两种培养基差异显著，在1/4SDAY和查氏培养基上无显著差异。YN2019在3种不同培养基上均能正常生长，菌丝直径表现为：PDA>1/4SDAY>查氏培养基;菌株在PDA培养基上菌丝日生长速率最快，且与其他两种培养基差异显著，在1/4SDAY和查氏培养基上无显著差异。
2.4不同培养基对菌株含水率、虫草素和虫草酸含量的影响
分别对虫草素和虫草酸标样进行LC-MS测定，可知虫草素的保留时间为：5.50min，标准曲线为：y=181744x，R2=0.9993;虫草酸的保留时间为：3.00min，标准曲线为：y=169.591x，R2=0.9936。不同菌株在3种培养基上含水率、虫草素和虫草酸含量见表6。
QH2019在PDA上菌丝含水率最低、虫草素和虫草酸含量最高，与其他两种培养基差异显著;菌株在1/4SDAY培养基和查氏培养基上的菌丝含水率与虫草素含量物明显差异，但虫草酸含量差异显著。
GL2019在查氏培养基上菌丝含水率最低，但虫草素与虫草酸含量最低，与其他两种培养基差异显著;菌株在PDA上菌丝含水率最高、但与1/4SDAY培养基无明显差异，虫草素和虫草酸含量最高与1/4SDAY培养基有显著差异。——论文作者：孟云1唐汉尧1施金铎2王敦1
转载请注明来自：http://www.lunwencheng.com/lunwen/nye/19847.html
