摘要:海草植株共附生大量具有合成植物激素、促进植物营养物质吸收和拮抗病原菌作用的促生菌，对海草的健康生长具有重要作用。本研究利用固氮、溶磷培养基从海南省新村湾泰来草(Thalassiahemperichii)和海菖蒲(Enhalusacoroides)植株中获得细菌131株，分布于36属61种，其中芽孢杆菌属(Bacillus)为优势属。通过可培养细菌的多样性分析发现，从泰来草分离获得细菌的OTU(OperationalTaxonomicUnit)数目、Chao和Shannon指数均高于海菖蒲，其具有更高的细菌多样性;而三种培养基中，应用PSM培养基获得的细菌的多样性最低。另外，对包括17株溶磷菌和12株固氮菌在内的61株菌进行促生特性分析，结果显示菌株L-2以C2H4计的固氮酶活性达14.27nmol/(h·mL)，有3株菌溶磷活性在29.91～44.86mg/L之间，6株菌产铁载体能力很强，8株菌氨化能力很强，10株菌吲哚乙酸(IAA)产量在50μg/mL以上。基于促生能力的综合分析，我们筛选出5株具有较强促生潜能的菌株，16SrRNA鉴定结果显示其中2株为芽孢杆菌(Bacillussp.)，1株克雷伯氏菌(Klebsiellasp.)，1株拉乌尔菌(Raoultellasp.)和1株Breoghaniasp.。它们适合进一步开发研制为微生物菌剂，可应用于促进移植海草生长发育和退化海草床生态保护修复中。
关键词:海洋生物学;泰来草;促生菌;固氮;溶磷;芽孢杆菌
海草床作为生物多样性和生产力最高的海洋生态系统之一，为海洋生物提供了栖息地和食物来源，并参与到碳、氮、磷和硫等的生物地球化学循环，具有重要的生态服务功能[1]。海草的生长极易受到氮、磷等营养元素的限制，但其根际和叶际共附生大量对宿主有益的微生物[2-5]，能将氮气和不溶性磷转化为铵盐和可溶性无机磷供海草吸收利用。此类细菌一般为植物促生菌(PlantGrouthPromotingBauteria，PGPB)，是一类具有促进植物生长、提高植物营养吸收效率和提高植物抗逆性的益生菌群，主要为植物内生菌、根际和叶际附生微生物[6]。PGPB可以通过直接或间接的途径来维持植物的健康生长[7]。间接途径一般是指促生菌通过分泌抗生素、蛋白酶等来帮助宿主植物抵抗病原微生物的入侵，诱导植物产生有效的系统抗性[7-10]。PGPB的直接作用主要包括合成植物激素和促进植物营养物质吸收。如促生菌可通过分泌吲哚乙酸(IAA)、细胞分裂素(CTK)和赤霉素(GA)等植物激素刺激植物生长，也可通过释放磷酸盐和硅酸盐等矿物质中的磷和钾，直接提高植物可吸收营养物质的浓度。
在农业上，PGPB已经作为微生物菌剂开发利用，能有效减少化学肥料的应用、改善盐碱地，帮助农作物对抗干旱、重金属污染和病原菌入侵[11-12]。陈倩等(2011)发现固氮菌Paenibacillussp.能拮抗小麦和棉花病原真菌，并使小白菜增重52%[13];Patel等(2017)发现内生固氮菌能在小麦根内定殖，并能显著增加小麦鲜重、干重、根长、叶长和促进其光合作用[14];葡萄糖酸杆菌(Gluconacetobacterdiazotrophicus)能缓解干旱胁迫，提高水稻产量和抗性[15]。PGPB作为农业益生菌剂的研究在国内外趋于成熟，但在海草研究领域还是一片空白，国内关于海草益生菌的分离培养及多样性也鲜有报道[16-18]。20世纪以来，由于人类活动和气候变化的影响，全球范围内的海草床正以每年7%的速率发生退化，导致海草床生态服务功能受到损害[1]，如海草床捕获的碳以每年299Tg的速率重新释放[2]。海草植株移植是目前修复海草床的主要方法之一[19]，但是移植后海草植株需要一段时间来形成稳定的微生物群落结构。因此，本研究拟通过富集培养和促生特性分析方法筛选出合适的海草促生菌，未来研制成微生物菌剂作用于移植海草根际，为植株提供N、P和Fe等营养物质并提高其适应性，对海草床生态系统修复具有重要意义。
1材料与方法
1.1样品采集及处理
采样地新村湾(18°24'34″N，109°57'42″E)位于我国海南省陵水县，其西部与南海相接，为天然泻湖，优势海草种类为泰来草(Thalassiahemperichii)和海菖蒲(Enhalusacoroides)。用无菌铲获得泰来草和海菖蒲的植株及根际沉积物，分装于无菌袋中，立即带回实验室处理。用无菌海水冲洗海草植株，将叶子和根分开。取0.5g冲洗干净并剪碎的海草叶子或根、0.2g根际沉积物，分别放入18mL无菌海水中摇匀，稀释成1×10-1和1×10-22个梯度，直接涂布于固氮菌筛选固体培养基中;取2g泰来草或海菖蒲根际沉积物至98mL选择性液体培养基中，28℃、180r/min的培养条件于摇床中富集培养，3、15d和30d后分别取混悬液稀释至一定浓度涂布于选择性固体培养基中。
1.2培养基
海草固氮培养基[20]:NaCl25g，MgSO4·7H2O4.8g，MgCl2·6H2O4.0g，蛋白胨4.0g，酵母提取物2.0g，KCl0.56g，Tris0.48g，K2HPO40.01g，FeSO4·7H2O0.001g，甘油2.0mL，去离子水1L，pH为8.2，固体培养基加入2%琼脂。Ashby无氮培养基[20]:D-甘露醇5.0g，NaCl5.0g，CaCO35.0g，KH2PO4·H2O0.2g，MgSO4·7H2O0.2g，CaSO40.1g，去离子水1L，pH为7.0，固体培养基加入2%琼脂。用于固氮菌的筛选。改良选择性解磷培养基(PSM)[21]:D-葡萄糖15.0g，NaCl25g，NH4NO35.0g，CaCl22.0g，KCl0.5g，MgSO4·7H2O0.5g，FeSO4·7H2O0.01g，MnSO4·7H2O0.01g，植酸钠4g(用少量水溶解，单独灭菌)，去离子水1L，固体培养基加入2%琼脂。用于溶磷菌筛选。
2216E液体培养基:购于青岛海博生物科技有限公司，固体培养基加入2%琼脂。用于细菌纯化后的传代培养、菌种保藏及促生能力验证。
1.3细菌DNA提取及PCR扩增
划线纯化后的菌株用试剂盒BacterialDNAKit(OMEGA)提取基因组DNA。引物27F(5’-GAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’)和1492R(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)用来扩增16SrRNA基因，PCR产物用琼脂糖凝胶电泳检测，条带清晰的送广州天一辉远基因科技有限公司进行测序。细菌16SrRNA基因序列导入EzBioCloud(https://www.ezbiocloud.net/)进行比对。
1.4促生特性测定
1.4.1固氮能力检测引物nifHF(5'-ATGTCGGYTGYGAYCCSAARGC-3')和nifHR(5'-ATGGTGTTGGCGGCRTAVAKSGCCATCAT-3')用来扩增固氮基因[22]，并用乙炔(C2H4)还原法测定菌株固氮酶活性[23]。固氮菌株在装有2216E液体培养基的50mL锥形瓶中摇瓶生长至对数期，随即转移到带有密封塞的小气瓶中，用注射器抽出5%的空气，同时打入等体积的纯乙炔，反应24h，用GC112A气相色谱仪检测乙烯和乙炔峰。用不同体积浓度的纯标准乙烯气体和乙烯峰面积制作标准曲线，R2>0.99。
1.4.2菌株溶磷活性检测采用钼锑抗比色法测菌株溶磷能力[24]。接种1%活化后的待测菌液(OD值为0.6)至20mL改良选择性PSM培养基中，置于摇床中28℃，160r/min培养5d，空白PSM培养基为对照。取1mL发酵液于4000r/min离心30min，吸取200μL上清液转入50mL容量瓶，滴加二硝基酚指示剂，调节pH至溶液微黄，加入5mL钼锑抗显色剂，摇匀定容。静置4h后于886nm处测定吸光度。根据制定的标准曲线计算溶磷量，R2>0.99。
1.4.3菌株产铁载体测定菌株产铁载体能力用CAS固体平板法检测[25]。先将待测菌株于2216E固体培养基上活化，用铂金丝挑起单菌落接种在CAS固体培养基上，28℃恒温培养箱培养5d，观察菌落周围是否出现橙黄色晕圈。一般晕圈越大、颜色越深，菌株产铁载体能力越强。
1.4.4菌株蛋白氨化能力测定将活化后的菌株接种到装有10mL蛋白胨溶液(蛋白胨10g/L，NaCl25g/L)的25mL锥形瓶中，28℃恒温培养箱培养3d，每瓶加入0.5mLNessler试剂(阿拉丁，上海)，菌液颜色由黄色转为橙色说明菌株具有氨化能力[25]。
1.4.5菌株产IAA能力测定菌株产IAA能力用Salkowski显色反应检测[26]。细菌在添加了L-色氨酸(终浓度为200μg/mL)的2216E液体培养基中28℃摇瓶培养3d，取2mL培养液10000r/min离心15min，小心吸取1mL上清液与2mLSalkowski显色液(50mL35%高氯酸与1mL0.5%FeCl3溶液混合)混匀，在室温下暗反应30min，测OD530。以IAA标准品(Sigma)梯度稀释液作标准曲线，空白培养基作对照，R2>0.99。1.5数据分析应用Excel2016整理数据和制作标准曲线，用Mothur软件对样品进行细菌多样性分析，包括OTU(OperationalTaxonomicUnit)数目、Chao、Shannon和Simpson指数。其中，Chao指数代表物种丰富度，Shannon和Simpson指数代表物种均匀度和多样性[27]。
2结果与分析
2.1泰来草和海菖蒲获得菌株初步鉴定及多样性
通过直接稀释涂布法和富集培养法分离筛选，初步从泰来草和海菖蒲根、叶和根际沉积物中分离纯化出可培养细菌131株，隶属于36属61种，芽孢杆菌(Bacillus)、弧菌(Vibrio)和希瓦氏菌(Shewanella)为优势属，分别占14.50%、10.69%和8.49%。获得菌株中有74株分离自泰来草，占27个属，13个属为其特有;海菖蒲有23个属，9个属为其特有。芽孢杆菌和弧菌同样在两种海草中占优势(表1、图1);两种固氮菌选择性培养基分离获得菌株111株，而只有20株菌分离自溶磷培养基(表1)。基于细菌多样性分析，泰来草样品OTU数目、Chao和Shannon指数均高于海菖蒲样品，表明泰来草分离细菌多样性高于海菖蒲(表2);三种培养基中，PSM培养基获得OTU数目最少，多样性最低，而海草固氮培养基Chao指数最高，多样性指数略高于Ashby培养基。
2.2菌株促生特性验证
2.2.1菌株固氮能力仅12株菌能扩增出固氮基因，主要包括弧菌、交替假单胞菌(Pseudoalteromonas)、Breoghania、Oricola和Salipiger5个属。经测定，菌株L-2(Breoghaniacorrubedonensis)以C2H4计的固氮酶活性达14.27nmol/(h·mL)。
2.2.2菌株溶解无机磷能力共17株菌在PSM培养基上有明显溶磷圈，基于16SrRNA鉴定主要来自3个种:新加坡克雷伯氏菌(Klebsiellasingaporensis)、解鸟氨酸拉乌尔菌(Raoultellaornithinolytica)和阿氏芽孢杆菌(Bacillusaryabhattai)。经钼锑抗比色法测定，代表菌株XHP-1(K.singaporensis)、XTP-5-1(B.aryabhattai)和XTP-9(R.ornithinolytica)的溶磷量分别为29.92、14.30、44.86mg/L，溶解无机磷能力较强(图2)。图2部分菌株在PSM培养基上产生的溶磷圈Fig.2PhosphatedissolvingringsproducedonPSMmediumbysomeisolatedstrains
2.2.3菌株产铁载体、产IAA和蛋白氨化能力根据CAS固体平板上晕圈的大小和颜色深浅判断菌株产铁载体的能力，结果发现大部分细菌都产铁载体，但有27株细菌产铁载体能力较弱，占总菌株数的44%。另外，只有RS-8、XTP-5-1、XTP-9、XTP11、XTN-1和XTN-7这6株菌的产铁载体能力为“+++”(图3)，分别属于贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)、阿氏芽孢杆菌(B.aryabhattai)、解鸟氨酸拉乌尔菌、嗜丝氨酸副球菌(Paracoccusseriniphilus)、需钠弧菌(Vibrioneocaledonicus)和希瓦氏菌属(Shewanellacarassii)。通过观察显色反应发现，约49%的供试菌(30株)不具有蛋白氨化能力，有9株菌的氨化能力较弱，而弧菌、希瓦氏菌和芽孢杆菌氨化能力最强。经Salkowski法测定，有41株菌产吲哚乙酸能力较弱(<10μg/mL)或不产，10株菌吲哚乙酸产量大于50μg/mL，其中7株菌的产量在113.69～179.48μg/mL之间，具有较强的产IAA能力，主要为弧菌、克雷伯氏菌和芽孢杆菌(表3)。
2.3根际促生菌系统发育分析
结合固氮活性、溶磷活性及其他促生特性分析，菌株L-2、XTA-9、XHP-1、XTP-5-1和XTP-9至少有3种或以上，促生能力较强，适合作为海草根际促生菌使用(表3)。对5株菌进行16SrRNA基因扩增，并在EzBioCloud数据库进行同源比对，下载序列相似性最高的参考菌株构建系统进化树(图4)。系统发育分析结果表明，L-2、XHP-1、XTP-9分别与BreoghaniacorrubedonensisUBF-P1、新加坡克雷伯氏菌、解鸟氨酸拉乌尔菌同源性最高，而XTA-9与巨大芽孢杆菌(BacillusmegateriumNBRC15308)相似性为99.24%，XTP-5-1与阿氏芽孢杆菌相似性为99.96%。——论文作者：林显程1，2，4，5，董俊德1，2，3，4，周卫国1，2，4，彭秋颖1，2，4，5，张健1，2，4，5，张颖1，2，4，5，杨清松1，2，4，唐小玉1，2，4，5，张燕英1，2，3，4，凌娟1，2，4*
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