摘要：Globo系列糖抗原Gb4广泛存在于多种细胞表面，参与细胞识别等多种生理活动，对机体生命活动起着重要作用.利用细胞工厂法大量合成Globo系列糖抗原Gb4，首先构建基因工程菌株，通过添加乳糖(Lac，二糖)为底物进行发酵，直接合成Gb4(四糖)，并采用单因素分析法，依次对受体底物质量浓度、糖供体的前体糖的种类和质量浓度、发酵温度以及发酵时间进行了优化，最后确定1g/LLac为最适受体底物，添加5g/L半乳糖(Gal)有利于糖供体UDP-Gal的合成，Gb4的合成产量提升了14倍，25℃为最适发酵温度，补加底物后21h为最适发酵时间.以此最适条件在摇瓶进行大量发酵合成，胞内获得纯度约96%的Gb4，1L发酵液可得到1.145g的Gb4.该法简便迅速，极大地减小了寡糖合成的工作量，为Gb4的大量合成及功能研究奠定了基础.
关键词：球形异四糖(Gb4);细胞工厂法;单因素分析
Globo系列糖抗原是一类存在于细胞表面的糖类抗原分子，参与细胞信号识别等生理作用[1]，包括Gb3(globotriose，Galα1，4Galβ1，4Glc)，Gb4(globotetraose，GalNAcβ1，3Galα1，4Galβ1，4Glc)，Gb5(globopentaose，Galβ1，3GalNAcβ1，3Galα1，4Galβ1，4Glc)以及Globo-H(Fucα1，2Galβ1，3GalNAcβ1，3Galα1，4Galβ1，4Glc)等(见图1).其中，Gb4是球形异四糖神经酰胺(globotetraosylceramide，Gb4Cer)的糖链部分，Gb4Cer又称为P抗原，研究发现其在人类结肠上皮细胞表面高表达，可与大肠杆菌O157∶H7产生的志贺毒素相结合[2]，且其中存在的Galα1，4Gal序列被证实是尿路致病性大肠杆菌菌毛末端PapG粘附素识别的最小结构[3]，因此可被用作毒素中和剂或抗粘附试剂等的开发.此外，由Gb4进一步修饰或衍生可以得到Gb5，SSEA-4以及Globo-H，它们能够在癌细胞上特异性表达，参与肿瘤转移、信号识别等过程[4]，因而也被广泛用于疫苗的开发[5-6].因此，大量合成Gb4是衍生出复杂寡糖以及研究Gb4和衍生寡糖链生理作用的基础和前提.由于糖链的合成与核酸或蛋白质不同，没有模板编码，而是需要相应的酶的作用，将底物单糖逐个添加到受体糖链上，单糖种类、所连位置、键的键型以及糖链是否有分支等差异，导致可能存在多种异构体，进而导致复杂糖链合成困难.
寡糖链的合成方法有化学合成法、酶法和细胞工厂法.化学合成法需要应用各种保护基团，只允许待反应的羟基暴露，反应完成后，再经脱保护步骤释放其他未反应的羟基.Seeberger等利用液相线性合成法，选择了6个糖基供体作为顺序组装的结构单元合成Globo-H，通过使相应的合成中间体脱保护，得到了Gb3和Gb5，三者最终收率均为40%左右[7];之后，他们又提出自动固相合成法[8]，通过在固相支持物上构建α-半乳糖苷键，对每个合成单体进行保护、脱保护，合成了Gb3和Globo-H，最终收率分别为46%和30%.这些反应步骤繁琐，总收率低，且对底物中新形成的糖苷键的立体选择性(α或β键型)也需严格控制，所以糖链的化学合成很有挑战性.酶法合成的优点在于反应迅速、条件温和、底物的区域和立体选择性强.Wang研究组通过体外纯化异源表达的α1，4-半乳糖基转移酶NmLgtC，合成了Gb3(百毫克级)和多种α1，4Gal-糖基衍生物(十毫克级到百毫克级)[9].Wong等使用过表达的糖基转移酶结合糖核苷酸的有效再生，实现了糖抗原Globo-H和SSEA-4的克级制备，其中以Lac作为对照，中间产物Gb4的收率为95%，纯度可达98%[10].但是酶法合成也有一定的局限性，如酶的大量纯化与保存的成本较高、作为供体的糖核苷酸昂贵[11]等，制约了酶法用于寡糖的大量合成.细胞工厂法是指将微生物活细胞作为一个“加工厂”，通过基因工程技术对其代谢途径定向改造，然后形成高效的“流水线生产工厂”[12-13].合成寡糖所需的各种酶的基因存在于一个细胞中，产生的多种酶不需要进行纯化，即可在细胞内依次合成糖核苷酸供体并进一步高效合成目标寡糖产物.Samain研究组以Lac为底物，利用细胞工厂法生产Gb3，产量达到7g/L，并利用该方法分别以Lac和Gb3为初始受体底物成功合成Gb4，产量分别为4.5，0.88g/L，但是在利用Lac为初始受体底物合成Gb4时，得到的产物是Gb3和Gb4的混合物，后期的产物纯化困难[14].
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微生物生长快、代谢旺盛、发酵过程易于控制，若能将细胞工厂法应用于寡糖的大量合成，可以大大降低成本.但是此方法并不能简单应用于所有寡糖的大量合成.由于合成目标寡糖所需的所有糖基转移酶共存于同一个“细胞工厂”内，如果有的糖基转移酶可以以细胞内的多种糖链作为糖基受体，将导致副产物产生，不利于均一产物的合成.因此，需要对合成路线精心设计，才有可能用细胞工厂法实现目标寡糖的大量合成.使用细胞工厂法合成Gb4，利用糖基供体的从头合成途径，内源性的UDP-Glc和UDP-GlcNAc分别在差向异构酶EcGalE和EcGNE的催化下形成合成Gb4所需的糖基供体UDP-Gal和UDP-GalNAc，并在α1，4GalT(NmLgtC)和β1，3GalNAcT(HiLgtD)的依次催化下，以乳糖(Lac)为受体，依次合成三糖Gb3和四糖Gb4[15](见图2，实线框标注的为转入基因的外源酶，虚线框标注的为敲除基因的酶).此外，LacZ是一种β-半乳糖苷酶，能够分解初始的受体底物Lac[16].因此，选择E.coliJM109(DE3)ΔlacZ为宿主菌，将上述酶的基因导入其中，然后利用摇瓶发酵形式，对受体底物质量浓度、糖供体的前体糖的种类和质量浓度、发酵温度和时间等条件进行单因素分析优化后，确定最适条件，并以此条件在摇瓶中大量合成了均一的Gb4糖链.
1材料与方法
1.1材料
1.1.1菌株及质粒
研究所用宿主菌株E.coliDH5α和E.coliJM109(DE3)ΔlacZ由本实验室保存(-80℃);E.coliTransT1购自北京全式金生物公司.外源基因所在质粒pETDuet1-EcgalE，pET15b-NmlgtC(BamHⅠ/SacⅠ)，pET15b-HilgtD(BamHⅠ/SacⅠ)，pUC19-Ecgne(NdeⅠ，XhoⅠ)和相容质粒(pACYCDuet1，pETDuet1)由本实验室保存.实验新构建重组质粒及基因工程菌株见表1.
1.1.2引物
基因扩增引物见表2，序列中划线部分为限制性内切酶位点.
1.1.3实验仪器
PCR仪(ThermoScientific)、核酸电泳仪(北京六一)、凝胶成像系统(基因公司)、净化工作台、全温培养摇床(上海智城)、分析天平(Shimadzu)、全功能电磁炉(美的)、ALPHA1-2LDplus低温冷冻干燥机(Christ)、分析型XBridge?BEHAmideColumn(130，3.5μm，4.6mm×250mm，Waters)、微量紫外分光光度计(ThermoScien-tific)、高效液相色谱系统(AllianceHPLC-ELSD，Waters)等.
1.1.4试剂
快速限制性内切酶购自ThermoFisher，包括BamHⅠ，SacⅠ，NdeⅠ，XhoⅠ;2×RapidTaqMasterMix，2×PhantaMasterMix均购自Vazyme;DNA分子量标准15kDNAMarker(TransGen);质粒小量提取试剂盒、PCR产物纯化试剂盒、胶回收试剂盒均购自Omega;液相级乙腈和甲醇购自Fisher-Scientific;乳糖、异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)购自上海生工;氨苄青霉素钠(Amp)、氯霉素(Chl)均购自索莱宝;半乳糖(D-Galactose)购自北京博奥拓达;其他常用化学试剂为国产分析纯
.1.2方法
1.2.1基因工程菌株的构建
以质粒pET15b-NmlgtC和pET15b-HilgtD为模板，特异性引物为lgtC-F/R和lgtD-F/R，利用PCR分别对NmlgtC和HilgtD基因进行扩增.PCR产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳分离、纯化.而后选择相应的限制性内切酶对上述纯化产物以及pUC19-Ecgne，pETDuet1-EcgalE和pACYCDuet1进行双酶切，纯化后用T4连接酶进行连接，构建出表达载体pETDuet1-NmlgtC-EcgalE和pACYCDuet1-HilgtD-Ecgne.将重组质粒共转入E.coliJM109(DE3)ΔlacZ感受态细胞中，复苏后涂布LB平板(Amp+Chl)培养，次日挑取单菌落培养成菌液后保存菌种.
1.2.2工程菌株生产Gb4的摇瓶发酵条件的单因素分析
1.2.2.1受体底物质量浓度的优化
将E.coliJM109(DE3)ΔlacZ，EcgalE，Ecgne，NmlgtC，HilgtD基因工程菌株的复苏菌液以1%(体积分数)的接种量转接至30mL的LB培养基中(Amp+Chl)扩大培养，37℃，180r/min，待OD600达到0.6～0.8时，冰上冷却后加入IPTG，使终浓度达到0.2mmol/L，18℃，180r/min，诱导目的蛋白表达.3h后，加入Lac作为受体底物，设置5种不同质量浓度(1，2，5，10，15g/L)Lac，18℃，180r/min，继续发酵培养.
1.2.2.2供体糖的前体糖的优化
从Gb4的生物合成途径来看，UDP-Gal对中间体Gb3的合成至关重要.为了提高Lac转化为Gb4的转化率，选择Glc和Gal对培养基中添加的供体糖的前体糖进行优化.诱导蛋白表达3h后，分别补加2，5，10，20g/LGlc或2，5，10，20g/LGal，24h后停止发酵.
1.2.2.3发酵温度的优化
为了保证细胞维持较低代谢水平，更多地表达目的蛋白，故采取18℃低温诱导.当加入Lac开始发酵生产Gb4时，分别在18，25，30℃条件下发酵，180r/min，24h后停止发酵.
1.2.2.4发酵时间的优化
发酵培养过程中，在添加Lac后的不同时间点(0，3，6，9，12，15，18，21，24h)，从发酵液中取出1mL菌液，24h后停止发酵.
1.2.3样品制备与检测
停止发酵后，离心收集菌体沉淀，同时保留培养基.菌体沉淀加入1mL去离子水洗涤一次.离心弃上清后再加入1mL去离子水重悬细胞(不同发酵时间取出的1mL菌液离心后分别加入20μL去离子水洗涤和重悬)，沸水浴30min，13000r/min离心30min，留上清液检测.从保留的培养基中取出1mL，同上述操作.利用HPLC-HILIC-ELSD进行产物检测，0.1mol/L甲酸铵水溶液(pH3.4)为流动相A，乙腈为流动相B.将制备好的样品取出20μL装入微量进样瓶中进行分析，分析方法设定如下：流速1mL/min，0～35min，B相80%～60%;35.1～45min，B相10%;45.1～55min，B相80%.
1.2.4摇瓶发酵大量合成Gb4
以上述优化的最适条件进行基因工程菌株发酵，扩大培养体积至4L.发酵结束后离心收集菌体沉淀，加入30mL去离子水洗涤和重悬细胞，后续处理和检测参照“1.2.3”.
1.2.5Gb4的纯化、定量及表征
发酵结束后处理的样品经Bio-gelP2聚丙烯酰胺凝胶柱(1.5cm×80cm)进行初步分离纯化2次，而后将所收集的纯化的样品浓缩，再使用半制备型氨基柱进行HPLC纯化，收集样品后利用真空冷冻干燥仪冻干.利用HPLC-HILIC-ELSD，根据不同质量Gb4标准品所对应的峰面积数值，在Empower3软件上制作出标准曲线.同时将纯化后的样品进行高分辨质谱(南开大学药学院)和核磁共振(江南大学)鉴定
.2结果与分析
2.1重组质粒的构建
成功扩增出NmlgtC和HilgtD基因，基因长度分别为936，972bp.采用酶切连接的方式将NmlgtC，HilgtD，Ecgne构建到相应的表达载体上.将重组质粒pETDuet1-NmlgtC-EcgalE和pACYCDuet1-HilgtD-Ecgne单酶切鉴定(见图3，4)，将条带正确的克隆送至金唯智公司进行基因测序，结果正确.
2.2摇瓶发酵条件的单因素优化
2.2.1受体底物质量浓度的优化
在基因工程菌株的发酵过程中，补加的底物质量浓度过低时，不足以合成产物;如果补加的底物质量浓度过高，不仅会影响菌的正常生长代谢，也会造成资源浪费.HPLC-HILIC-ELSD的检测结果显示，当添加的Lac质量浓度升高时，胞内Gb4的产量并无明显增加，由此推测可能是因为UDP-Gal的供应量不足，导致Gb3的合成受限，进而限制了Gb4的产量.结合胞内胞外HPLC分析结果，工程菌株生产Gb4摇瓶发酵时最适受体底物的质量浓度为1g/L(见图5，不同颜色线条自下而上分别对应1，2，5，10，15g/LLac).
2.2.2供体糖的前体糖的优化
Glc一方面可作为UDP-Glc的前体糖用于合成UDP-Gal，另一方面也可作为碳源被细胞消耗;有研究发现，补加Gal能显著增加胞内UDP-Gal的含量[17].图5表明，UDP-Gal供应不足时会影响最终产物Gb4的产量，因此可以通过分别补加Glc和Gal来增加胞内UDP-Gal的含量，从而提高Gb4产量.检测结果显示，当Lac质量浓度为1g/L，补加低质量浓度Glc(2g/L)时，副产物Gb3的含量较低，乳糖转化率可达到80%，但随着Glc质量浓度的升高，产生了葡萄糖抑制现象，产量下降(图6a，不同颜色线条自下而上分别对应2，5，10，20g/LGlc);当添加5g/LGal时Gb4的产量显著增高，是未添加Gal时的14倍，是添加2g/LGlc时的11倍，且剩余Lac和Gb3的量最少(图6b，不同颜色线条自下而上分别对应2，5，10，20g/LGal).因此，补加的5g/LGal为最适量的前体糖.
2.2.3发酵温度的优化
低温有利于重组质粒稳定遗传及重组目的基因的表达[18]，且低温可减少细胞负荷，但是相对高的温度对于酶促反应有利，因此分析了18，25，30℃时发酵的目的寡糖合成情况(见图7).结果显示，18℃诱导3h表达糖基转移酶后，发酵温度提高至25℃的培养液Gb4的产量高于18，30℃时Gb4产量.其原因可能是25℃时，所表达的目的蛋白能够发挥催化活性合成四糖产物;18℃时，酶的催化活性较低;而发酵温度30℃时，Gb4产量有所下降，可能是温度升高导致质粒的稳定性下降，传代过程部分质粒丢失.因此，25℃为最适发酵温度.
2.2.4发酵时间的优化
在摇瓶发酵过程中，随着时间的延长，产物会逐渐积累.但是由于装液量受限，培养基成分消耗较快，甚至积累的产物会被菌体再次消耗利用，从而导致产量降低.根据HPLC-HILIC-ELSD检测结果显示，在25℃，添加1g/LLac发酵条件下，随着时间延长，Gb4合成量呈上升水平，21h达到最大值，之后随着时间延长会有微弱降低趋势(见图8).因此，补加底物后21h为最适发酵时间.
2.3大规模摇瓶发酵合成Gb4的分离纯化、定量与表征
为了保证受体底物充足，将Lac的质量浓度提高至2g/L，其他条件不变.经检测获得纯度较高的Gb4，胞内的Lac转化率达96%以上(见图9a).检测胞外产物发现，有一部分Gb4运输至胞外(见图9b).经细胞工厂法合成糖链时，细胞中包含多种物质，如酶蛋白、残留的糖核苷酸供体、多余糖基受体及各种副产物.为了对所得糖链进行定量分析，需要获得纯度较高的糖链.由于Gb4几乎是胞内唯一的糖链，经过2次Bio-gelP2凝胶过滤柱的纯化，可以简便地将目的糖链Gb4与其他较大或较小分子量的组分分离，再使用氨基柱进行HPLC纯化.对纯化的产物进行分析，纯度可达到99%以上(见图10).——论文作者：王晓雨1，白静1，2，王志颖1，周子璇1，关婉怡
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