摘要：本文旨在探究超高压和巴氏杀菌前处理对植物乳杆菌在梨汁中增殖代谢情况以及对发酵梨汁风味品质的影响。对发酵过程中梨汁的活菌数、pH值及总糖总酸含量进行测定，利用静态-顶空固相微萃取(HS-SPME)和气质联用(GC-MS)分析梨汁发酵前后的挥发性风味化合物的变化，并对发酵前后的梨汁进行风味感官评价。相比于热处理，超高压前处理能更好地保持梨汁原有的风味，且杀菌梨汁的刺激性更小。两种前处理方式对发酵梨汁中挥发性风味物质的影响差异显著(P<0.05),经植物乳杆菌发酵后，超高压前处理梨汁中挥发性醇、酯、烷酮的含量分别增加了36.47%、95.43%、80.00%，挥发性烯烃、醛的含量分别减少了7.56%、27.00%;巴氏杀菌前处理梨汁中挥发性醇、酯、烯烃的含量分别增加了63.83%、25.67%、17.82%，醛的含量减少了4.08%，烷酮从未检出增至0.90mg/L。相比于巴氏杀菌前处理发酵梨汁，超高压前处理发酵梨汁中挥发性醇、酯和烯烃的含量均更高(P<0.01)，而挥发性醛和烷酮的含量均更低(P<0.05)，这使得超高压前处理发酵梨汁更具新鲜气息。
关键词：植物乳杆菌;发酵梨汁;挥发性风味物质;超高压处理;巴氏杀菌
近年来，受素食主义流行，乳糖不耐受、高胆固醇、乳蛋白过敏患者增多等影响，非乳基发酵越来越受欢迎[1,2]。果汁被认为是开发非乳制品益生菌饮料的理想基质，因为果汁中含有维生素、有机酸和多酚等活性物质[3]，同时其高含量的糖和其它营养素有助于益生菌的生长[4]。以果汁作为载体，快速通过胃部恶劣酸性环境，还能提高益生菌的活性[2]。用于发酵果汁的益生菌多为乳酸菌，它们通常被认为是安全无毒的，无致病性、致癌性，已在世界范围内被公认为“GenerallyRecognizedasSafe(GRAS)”等级的食品微生物[5]。
乳酸菌发酵不仅能提升果汁营养价值、延长货架期，还能赋予其独特的风味，这使得发酵果汁备受消费者的青睐。植物乳杆菌发酵枣汁能增加芳香化合物，并减少导致不愉快气味的硫有机化合物的产生[6]。鼠李糖乳杆菌和木葡糖醋酸杆菌共同发酵的龙眼汁与对照组相比，苦味游离氨基酸含量显著降低，而酮和个别挥发性成分的总量增加，果汁的整体风味得到提升[7]。石榴汁经植物乳杆菌作用后，醇、酮和烯烃、萜烯和苯衍生物的含量增加，花香和水果味更浓郁[8]。果汁中的风味化合物至少上百种，乳酸菌对这些化合物的代谢及自身产生的新物质都会改变果汁的风味品质，这其中的作用机理仍需深入研究。
在确定接种的菌株后，发酵前的杀菌方式是影响发酵果汁风味品质的主要因素。果汁制备过程中，果皮中携带的微生物容易混进果汁，可能造成果汁微生物污染，因此在制备发酵果汁前需要先进行杀菌处理。传统上，果汁在微生物发酵前通过热处理进行巴氏灭菌，但由于温度过高，会造成营养、色泽及风味的损失[1,9]。超高压处理是一种非热杀菌技术，在灭活腐败和致病微生物的同时，几乎不影响果汁的感官品质和营养价值[10,11]。已有诸多文献报道了超高压和热处理果汁的挥发性风味物质和物化特性[12-15]，然而这两种杀菌方式对果汁在发酵过程中风味品质的影响少有被评估。本文选取梨作为发酵原料，其较高含量的碳水化合物为乳酸菌的增殖代谢提供有利条件，且发酵后的梨汁有较好的营养和感官品质[16]。菌种则采用生长活性强，且能提高果汁风味品质的植物乳杆菌。通过测定植物乳杆菌发酵梨汁前后的活菌数、pH值及总糖、总酸和挥发性风味物质，探究超高压处理和巴氏杀菌对植物乳杆菌生长代谢情况和发酵梨汁风味品质的影响，以期为加工生产高品质乳酸菌发酵果汁提供理论依据。
1材料与方法
1.1材料与试剂
市售蜜梨(Pyruspyrifolia)，选择成熟度合适、无明显缺陷的果品;植物乳杆菌(L.plantarum)LP115，杜邦·丹尼斯克公司。
1.2仪器与设备
UUPF/5L/800MPa型HPP处理设备，包头科发高压科技有限责任公司;BSH-2数显恒温水浴锅，江阴市保利科研器械有限公司;7890B-7000C三重四级杆气质联用仪，安捷伦公司;手动进样柄，美国Supelco公司;萃取头(65μm，PDMS/DVB)，美国Supelco公司。
1.3方法
1.3.1样品处理
梨汁制备：梨洗净，去除果核，迅速榨汁后过100目纱布，得到鲜榨梨汁(FJ)，待测指标;每150mLFJ分装于250mL洁净无菌锥形瓶中，硅胶塞密封，将果汁迅速加热至80℃，水浴保温10min，流水冷却至40℃，得到巴氏杀菌梨汁(PJ);将FJ用塑封袋进行真空包装，于400MPa保压15min处理得到超高压处理梨汁(UHPJ)，无菌操作下，每150mLUHPJ分装于250mL洁净无菌锥形瓶中。
前处理对发酵梨汁风味品质的影响：植物乳杆菌分别接种于PJ和UHPJ中，初始活菌数约为7.00lgCFU/mL，于37℃恒温箱静置发酵48h。取0h、3h、6h、12h、24h、48h时的样品，测定活菌数、pH值及总酸总糖含量，分析对比鲜榨梨汁(FJ)、未发酵巴氏杀菌梨汁(PJ)和发酵24h的巴氏杀菌前处理梨汁(F-PJ)、未发酵超高压前处理梨汁(UHPJ)和发酵24h的超高压前处理梨汁(F-UHPJ)中的挥发性风味物质，并进行风味感官评价。
1.3.2活菌数及常见理化指标的测定
活菌数：参照GB4789.2-2016，采用稀释平板计数法进行测定，每组3个平行;pH值：参照GB/T10468-1989，用pH计在室温下直接测定发酵液的pH，每组3个平行;总酸：参照GB/T12456-2008，采用酸碱滴定法进行测定，每组3个平行;总糖：采用3,5-二硝基水杨酸比色法[17]，测定发酵液的OD540值，每组3个平行。
1.3.3挥发性风味化合物的测定
采用顶空固相微萃取(HS-SPME)法：将固相微萃取头(PDMS/DVB65μm)在气相色谱的进样口老化，老化温度为250℃，载气体积流量为1.20mL/min，老化时间为1h。准确移取10mL样品于20mL螺口进样瓶中，加入3.00gNaCl，促进香气成分的挥发[18]，加入1μL内标物环己酮[19]，用聚四氟乙烯隔垫密封，45℃环境下于磁力搅拌器中平衡20min。平衡后将SPME萃取头通过隔垫插入进样瓶1cm，推出纤维头，使其置于样品瓶顶空吸附40min，随后取出萃取头，立即插入GC仪的进样口，插入深度为2cm，推出纤维头，解析5min，同时启动仪器收集数据。
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气相色谱(GC)条件：DB-5MS毛细管色谱柱(30m×0.25mm，0.25μm);进样口温度250℃，载气为He(纯度99.999%)，流速1.93mL/min。不分流进样。升温程序：起始温度为40℃，保持3min后以4℃/min的速度升温至120℃，再以6℃/min的速度升温至240℃，保持9min。
质谱(MS)条件：电子轰击电离(EI)，电子能量为70eV，离子源温度为230℃，接口温度为230℃，质量扫描范围为m/z35~500。
1.3.4风味感官评价感官评价
小组由10名事先经过培训的食品专业人员组成(22~30岁，男女均等)，评价指标及描述见表1。每项指标的评分分值范围为0~10分。
1.3.5数据分析
采用GraphPadPrism8.0.2分析pH、总糖和总酸的均值和偏差。在利用NIST14质谱数据库检索的基础上，结合C7~C30正构烷烃系列外标的保留指数对化合物进行定性;选择匹配度大于85的物质作为有效的香气成分，按峰面积归一化进行相对定量，按式(1)计算挥发性风味物质的含量。通过仪器所配置的Nist08.LIB和Nist08s.LIB谱库进行自动检索，结合相似度并参考有关文献色谱保留指数进行定性，采用内标法半定量计算各香气成分的含量。
2结果与分析
2.1超高压和巴氏杀菌前处理梨汁对植物乳
杆菌增殖代谢的影响图1反映了超高压和巴氏杀菌前处理对植物乳杆菌发酵梨汁时的活菌数、pH值及总糖总酸含量的影响。发酵期间，植物乳杆菌生长良好，两种前处理的发酵梨汁各指标的变化趋势一致。接种后的0~3h为迟缓期，植物乳杆菌适应梨汁的酸性环境，仅有少部分开始生长繁殖;3~6h，菌种开始大量利用梨汁中的糖、氨基酸等物质进行增殖代谢，进入对数生长期;6~12h，由于营养物质消耗以及代谢产物累积，菌种增长速度开始减慢;12~24h，菌种增殖速度继续减慢，并逐渐进入稳定期，24h左右，活菌数达到最大值9.72lgCFU/mL(超高压处理)和8.91lgCFU/mL(巴氏杀菌);24h后，生存环境恶化及营养物质限制导致菌种生长迟缓或衰退，活菌数逐渐下降。整个发酵过程中，不同杀菌前处理的发酵梨汁总酸和总糖含量无显著差异，相对应的两条折线图基本重合。最终总糖还剩约10g/100g，总糖利用率较低(10.26%)，这可能与接种量较小、鲜梨汁的酸度较高等有关，一定程度上限制了植物乳杆菌对梨汁中总糖的消耗。发酵6h后，超高压前处理梨汁的活菌数始终略高于巴氏杀菌前处理梨汁，这可能是因为超高压处理更好地保留了梨汁原有的营养，更利于植物乳杆菌的生长。据报道，相比于热处理，超高压处理果汁的糖组成与鲜果汁更接近，更利于乳杆菌耗糖产酸[7]。另外，超高压处理会增加原料中游离氨基酸的总量，可以促进乳酸菌的生长[20]。还有研究者发现，经超高压处理后，饮料中多酚氧化酶、过氧化物酶、脂肪氧合酶等酶的活性降低，间接促进了酚类化合物的释放，而一定浓度的酚会减轻乳酸菌的氧化应激，更利于其增殖[21,22]。超高压前处理梨汁的pH值始终略低于巴氏杀菌前处理梨汁，这是由于超高压作用能促进弱酸的电离平衡向生成H+的方向进行[23]，李俊芳[24]也得出相同结论，经超高压杀菌处理后，桑葚发酵饮料的pH值显著下降(P<0.05)。
2.2超高压处理和巴氏杀菌对植物乳杆菌发酵梨汁中挥发性风味物质的影响
由图2可知，FJ的出峰数量要多于PJ，而少于UHPJ，说明巴氏杀菌使鲜榨梨汁中的挥发性化合物数量减少，而超高压处理则利于梨汁中挥发性风味物质的生成。热处理作用于其它果汁也有类似的结果，Perez-Cacho和Rouseff[25]报道了橙汁经热处理后，由于一系列复杂的化学反应而导致化合物的损失，最终影响橙汁的香气;Wang等[26]研究了超高温瞬时杀菌和巴氏杀菌对西瓜汁香气的影响，两种热处理使检测到的挥发性物质种数从原来的27种分别减至21种、22种。经植物乳杆菌发酵24h，超高压处理梨汁和巴氏杀菌梨汁的挥发性风味物质总峰面积和总峰数均增加，前者的总峰面积增量更大，而后者的总峰数增量更大。两种前处理梨汁的色谱图中保留时间5~10min对应的峰面积显著减少，而保留时间15~30min对应的峰面积显著增加，说明植物乳杆菌发酵能显著改变梨汁中挥发性风味物质的分布。
在鲜榨梨汁中共检出21种挥发性风味物质，包括9种醇、5种酯、4种醛和4种烯烃(表2)，其中醇类挥发物含量最高(49.69%)，其次是酯(28.09%)和烯烃(19.68%)。大部分挥发物与梨汁之前的研究一致[27-29]，新检出4种醇：芳樟醇、L-薄荷醇、正戊醇和环己醇，这种差异与梨的品种、成熟条件和香气提取方法等因素有关。鲜榨梨汁经前处理杀菌后，其挥发性物质的种类和含量均发生变化，但相比于巴氏杀菌前处理梨汁，超高压前处理梨汁与鲜榨梨汁中挥发性风味物质的分布更相似(图3)。巴氏杀菌显著降低了梨汁中醇和烯烃的含量，分别从初始的6.44mg/L和2.55mg/L降至0.94mg/L和1.72mg/L，另外，醇类物质种类数也从6降至3。醇可作为其它芳香化合物的溶剂，对果汁的整体香气有显著的贡献，而烯烃则可以赋予果汁独特的香气[8,30]。因此，挥发性风味化合物种类和数量的减少证实了巴氏杀菌对果汁风味的感官有负面影响。这一结果与多数现有文献一致，Lu等[31]发现热处理过程中，甘蔗汁中大多数气味宜人的挥发性化合物都会丢失;Yang等[32]从热处理的西瓜汁中检出5种主要异味化合物，其中辛醇、二异丙基二硫醚和2-癸烯醛被鉴定为最关键的异味化合物;An等[33]报道了热杀菌使荔枝汁中15种化合物的气味活性值增加，其中二甲基硫醚、甲硫醇、二甲基二硫醚、二甲基三硫醚和2,4-二硫戊烷表现为煮熟白菜、马铃薯、大蒜、洋葱和硫磺味，这些物质对荔枝汁的整体香气有显著负面效应。相比之下，超高压处理的果汁基本不会产生异味物质，能较好地保留新鲜果汁原有的风味。与热杀菌相比，超高压前处理的猕猴桃汁与新鲜猕猴桃汁在15种主要香气成分的分布上更相似，因为高压环境能抑制酯类、醇类等香气成分的挥发[34]，类似的结果也出现在超高压处理的桑椹汁中，其挥发性成分的含量高于新鲜桑椹汁，且新检出8种醇、2种酯和2种烯烃[35]。
醇被认为是果汁芳香成分中的主要化合物，是葡萄糖降解和氨基酸分解代谢的常见终端产物[36]。在5组样品中共检出22种醇，其中17种为不饱和醇，其风味比饱和醇更强烈。α-松油醇、2-甲基-1-丁醇和4,4-二甲基环己烯醇仅在巴氏杀菌前处理梨汁中检出，而9,12-十八碳二烯醇、异胡薄荷醇、黑檀醇和9,12-十四碳烯-1-醇仅在超高压前处理梨汁中检出，表明这些成分特定于加工的梨汁，其主要由萜烯和其它前体化合物经一系列水合、脱水反应而形成[25]。经前处理杀菌后，鲜榨梨汁中的醇类物质总量均降低，但热处理影响更显著，这与其它果汁加工时的情况相同[37,38]。梨汁中醇类化合物减少是因为热处理和超高压处理加速了醇类物质的代谢转化，首先醇和有机酸进行酯化反应，导致其含量减少，对应酯类化合物含量增加;其次，醇还可转化成其它物质，例如D-柠檬烯和芳樟醇在受热条件下发生氧化反应，生成具有松节油香气的α-松油醇，该物质的含量在果汁中升高，则标志着果汁开始陈化、新鲜度降低[39]。经植物乳杆菌发酵后，超高压和巴氏杀菌前处理梨汁中醇的种类和含量均增加，前者增加的多为不饱和醇，而后者增加的多为饱和醇。这说明超高压前处理梨汁能促进植物乳杆菌生成饱和醇，降解不饱和醇。
挥发性酯类由短链游离酸与醇酯化形成，对梨汁的香气有重要贡献，已有研究表明酯类含量增加可进一步提升发酵果汁的香味[40]。经超高压、巴氏杀菌前处理后，鲜榨梨汁中酯类物质的总量从初始的3.64mg/L分别增至4.16mg/L和4.09mg/L，对应的种类数从5分别增至10和6。鲜榨梨汁中原有的酯含量经超高压前处理后变化不明显，新增的酯类中2-甲基-2-乙基丁酸乙酯的含量最高，达到0.24mg/L。超高压前处理后的梨汁中酯类含量增加，可能是由于超高压促进了果汁中相关酶的活化。Pei等[41]发现，与未经处理的哈密瓜汁相比，400MPa静水压处理后，新增了3种酯，而在静水压为500MPa时继续新增4种酯。经植物乳杆菌发酵后，超高压和巴氏杀菌前处理梨汁中均检出新的酯类化合物，但原有的物质含量变化较小，酯总量的增加主要来自新生成的3-甲基戊基甲酸酯，该物质与丁酸乙酯在发酵梨汁中的含量显著高于其它酯(P<0.01)。——论文作者：张平1，阮征1，李汴生1,2*
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