摘要为观察气道高反应大鼠肺组织AQP4和AQP5的表达对呼吸道粘液分泌量和质的影响，取24只SPF级Wister大鼠随机分为3组：正常对照组;气道高反应组;气道高反应+糖皮质激素治疗组;每组8只.各组依次检测大鼠的气道粘液分泌总量、肺组织AQP4和AQP5的表达量、肺组织MUC5B的表达量，分析AQPs(AQP4、AQP5)的表达和粘液分泌量、MUC.5B的表达之间的关系.结果显示，气道高反应组大鼠AQP4、AQP5的表达明显低于正常对照组，气道高反应组大鼠的气道粘液分泌总量和MUC5B的表达明显高于正常对照组，较气道高反应组经糖皮质激素治疗后肺组织AQP4、AQP5含量增多，MUC5B表达有下降，气道粘液分泌总量减少.以上结果提示，在气道高反应过程中，AQPs(AQP4、AQP5)的表达下调可增加粘蛋白MUC5B的表达和气道粘液分泌量.
关键词气道高反应性;水通道蛋白;粘蛋白
呼吸道粘液由粘蛋白(mucin，MUC)和水溶性成分两部分组成.粘蛋白是一种富含碳水化合物的糖蛋白，目前已知有7种粘蛋白(MUC5B、MUC5AC、MUC1、MUC2、MUC4、MUC7和MUC8)在呼吸道表达，其中MUC5B的表达较为丰富.水溶性成分是指无机盐如NaC1，小分子有机物葡萄糖、氨基酸、多肽类和脂质等.呼吸道粘液在生理条件下有少量分泌，主要起过滤、清洁、润滑呼吸道的功能¨.当气道上皮受损失稳态时，呼吸道粘液分泌量出现异常，粘蛋白作为粘液的主要功能成分，其表达量和种类也会出现较大变化.水通道蛋白(aquaporin，AQP)，又名水孔蛋白，是一类位于细胞膜上的蛋白质，1988年Agre等首次在红细胞膜上发现，1991年完成cDNA克隆，并最终确定它是控制水进出细胞的通道.迄今认为有13种，依次命名为AQP0～AQP12，具有多种生理功能，同时它也参与多种病变的发生和发展.目前气道粘液分泌及其调节的研究主要集中在环境刺激因素、炎症细胞和炎症介质的作用、对粘蛋白基因表达有影响的细胞因子等方面.研究表明，呼吸系统有6种水通道蛋白表达，分别是AQP1，AQP3，AQP4，AQP5，AQP8和AQP9.其中AQP4在整个气道上皮基底侧细胞膜上表达丰富，AQP5在粘膜下腺体的腺泡细胞管腔侧细胞膜上有大量表达J.气道失稳态时，AQP4和AQP5表达的变化与气道粘液分泌的关系研究鲜见报道.本研究通过臭氧攻击致气道上皮损伤，形成气道失稳态，建立气道高反应动物模型_6J，分别检测各组大鼠的气道粘液分泌总量、肺组织AQP4和AQP5的表达量、肺组织MUC5B的表达量，分析AQPs(AQP4、AQP5)的表达、粘液分泌量、MUC5B的表达之间的关系，为阐述气道高反应时粘液分泌的机制打下良好的理论基础.
1材料和方法
1.1材料
1.1.1主要试剂氯仿、异丙醇(广州威佳)，琼脂糖(北京百晶生物)，引物合成(上海生工)，DEPC水(鼎国生物)，兔抗鼠一AQP4单克隆抗体(SantaCruz公司)，兔抗鼠一AQP5单克隆抗体(SantaCruz公司)，辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(康成生物公司)，逆转录试剂盒(捷瑞生物)，脱氧核糖核酸酶(TaKaRa公司)，TEMED(上海佳合)，Trizol(北京赛博)，ECL发光试剂盒(Pierce公司).1.1.2实验动物SPF级Wister大鼠24只，体重(200±10)g，由湖南农业大学动物实验部提供.
1.2方法
1.2.1实验分组和模型制备SPF级Wister大鼠24只随机分为3组，每组8只：正常对照组;气道高反应组;气道高反应+糖皮质激素治疗组.正常对照组：放置于空气流通的鼠笼中饲养;气道高反应组：每天用臭氧发生器定时在鼠笼中连续释放3.926mg/m臭氧1h;正常对照组和气道高反应组共计饲养6d，第7d起，这两组每天给予2.0mkg生理盐水腹腔注射，共3d;气道高反应十糖皮质激素治疗组：每天用臭氧发生器定时在鼠笼中连续释放3.926mm臭氧1h，共计6d，第7d起，每天给予2.0mg/kg糖皮质激素腹腔注射治疗，共3d;第lOd，各组动物均股动脉放血致死，取右肺组织约10mg，用去除RNA酶的小剪刀在Trizol中剪碎，放置到一7OcI=的液氮中以备检测.
1.2.2支气管分泌粘蛋白总量测定取各组动物肺组织采用过碘酸一雪呋(periodicacidschif，PAS)染色.中性甲醛液固定，石蜡包埋，切片后常规脱蜡至蒸馏水，浸洗1min，滴加高碘酸氧化20min，蒸馏水洗切片，滴加Schif染液40min，蒸馏水洗涤10min，滴加苏木素染液10min，蒸馏水冲洗，脱水透明封固，滴加中性树胶后加盖玻片.用病理图像分析仪进行图像采集和图像分析，染色切片随机编号，盲法选择进行分析.每一切片测定气道上皮总面积、气道杯状细胞数和PAS染色阳性面积，统计分析所有标本的上皮粘液储备指数(上皮PAS阳性染色面积比气管上皮总面积)和杯状细胞化生指数(指每毫米气管上皮中杯状细胞数目)，作为气道粘液的定量观察指标.
1.2.3荧光定量RT—PCR检测各组肺组织AQp4、AQP5和MUC5BmRNA的表达参考Trizol试剂说明提取各组肺组织总RNA，取2RNA进行琼脂糖电泳，确定其完整性;按逆转录试剂盒操作说明合成cDNA，其中2ixLcDNA为模板扩增，使用PrimerExpress5.0软件设计引物.口一actin为内参照，上游引物：5一ACGGC—CAGGTCATCACTATrG一3;下游引物：5一TGGATGCCACAGGATrCCAT-3;AQP4的上游引物5一GGTGTGG—GATCCACCAACT-3;AQP4的下游引物5一CAGTCACAGCGGGA1_rGATG-3;AQP5的上游引物5.GCGCTCAGCAACAACACAAC一3;AQP5的下游引物5一GTGTGACCGACAAGCCAATG.3.MUC5B的上游引物5一GAGGGCCTGATCCTGTTrGA-3;MUC5B的下游引物5一AAGcAcGcc伽℃1TrGcT-3，琼脂糖凝胶上电泳，凝胶成像分析系统分析扩增产物并拍照.
1.2.4WesternBlot检测各组大鼠肺组织AQP4、AQP5和MUC5B表达使用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定各组标本的蛋白质浓度，取50g样品加入适量的2XSDS—PAGE样品缓冲液，沸水煮10min，进行SDS.聚丙烯酞胺凝胶电泳(SDS—PAGE)，后用湿转法将蛋白质转移至PVDF膜，置于含脱脂奶粉的TBS封闭液封闭，室温轻轻振荡1h.封闭结束后加入第一抗体溶液(封闭液稀释，体积比1：500)，去除袋内所有气泡，用封膜机封口，4℃静置过夜.后取出PVDF膜置于一平皿中，用TBST漂洗后再浸洗3次，每次10min.将膜放入另一塑料袋中，加入辣根过氧化物酶标记的第二抗体溶液，室温轻摇1h.取出PVDF膜用TBST漂洗后再浸洗3次，每次10min.最后用ECL化学发光法显影，暗室曝光冲印，用凝胶成像仪测灰度，取均值.
1.2.5统计学处理数据均以x士s表示，用SPSS12.0进行统计处理.统计学方法采用成组设计的t检验和Pearson相关检验分析相关性，以P<0.05时判定差异有统计学意义。
2结果
2.1大鼠支气管分泌粘蛋白总量的变化
肺组织PAS染色发现，正常对照组几乎无紫蓝色的PAS染色阳性颗粒;气道高反应组有大量紫蓝色的PAS染色阳性颗粒，表明粘液大量分泌.气道高反应+糖皮质激素治疗组PAS染色阳性颗粒明显减少，提示粘液分泌量在治疗后有所减少，用上皮粘液储备指数和杯状细胞化生指数对粘液进行定量分析显示，经臭氧攻击后，气道高反应组大鼠粘液分泌量较正常组明显增多(P<0.05)，经糖皮质激素治疗后，粘液分泌量有显著下降(P<0.05)(见表1，图1).
2.2大鼠肺组织AQP4、AQP5和MUC5BmRNA的变化
各组样本中AQP4、AQP5和MUC5BmRNA含量计算如下：目的基因量=2-37，ACT是目的基因和看家基因的循环域值的差值(ACT=CTaet-CT2cim).数据通过对照组进行标化.AACT=(CTa.-CTactin)实检组一(CTmn-CT2can)升期。每个目的基因表达量因此被描述为对照组的倍数.分析数据表明：臭氧攻击后，气道高反应组AQP4、AQP5mRNA较正常组表达减少，MUC5BmRNA的表达出现明显增多(P<0.05);经糖皮质激素治疗后，AQP4、AQP5mRNA的表达较气道高反应组有所增多，MUC5BmRNA的表达则出现下降(P<0.05)(见图2，图3).WesternBlot检测结果与RT-PCR一致(见图4，图5).
2.3大鼠肺组织AQPs(AQP4、AQP5)的表达与粘液分泌量、MUC5B的表达的相关性
通过臭氧攻击致气道上皮损伤，形成气道失稳态，建立气道高反应动物模型，WesternBlot和荧光定量RT-PCR对各组动物肺内的AQP4、AQP5和MUC5B进行定量，同时，用上皮粘液储备指数和杯状细胞化生指数对粘液分泌进行定量，相关数据分析后提示，在气道高反应过程中，AQP4、AQP5表达出现下降，粘蛋白MUC5B表达增高，粘液总量增多;经糖皮质激素治疗后，AQP4、AQP5的表达较气道高反应时有所增加，MUC5B的表达和粘液分泌量较气道高反应时有所减少.统计分析各组大鼠的AQPs(AQP4、AQP5)的表达量、粘液分泌量、MUC5B的表达量，结果表明：AQPs(AQP4、AQP5)的表达与粘液分泌量呈现负相关(r=-0.9468，P<0.01)的趋势;AQPs(AQP4、AQP5)的表达与MUC5B的表达呈现负相关(r=-0.9412，P<0.01)的趋势(见图6).
期刊推荐：《中国实验动物学报》(双月刊)1993年创刊，是由中国实验动物学会主办并发行的国家级学术期刊。刊载有关实验动物和动物实验的理论专著、科研成果论文、科学实验新方法、新材料、实验动物新资源开发、新的动物品系的培育和应用以及与实验动物相关的其他学科的科学论述。
3讨论气道高反应性是指气管对各种刺激呈高度敏感状态-8J，是支气管哮喘的主要特征和诊断依据.本实验室前期研究已经证实连续吸人一定量的臭氧，可致气道上皮损伤脱落，出现气道失稳态，最终导致气道高反应性.本实验结果显示，气道高反应时，模型动物表现为行动迟缓、焦躁、鼻翼扇动、呼吸急促、喘息等症状，呼吸道粘液分泌明显增加，MUC5B的表达上调，经糖皮质激素治疗后，气道高反应症状得到控制，MUC5B表达有所下降，粘液分泌量较气道高反应时减少，作者认为MUC5B的表达可能改变粘液分泌量.
AQPs是细胞膜转运水分子的特异性蛋白质家族.AQPs对气道高反应过程中粘液高分泌的作用并不十分清楚.song等的研究认为AQP4和AQP5基因剔除小鼠，呼吸道粘液分泌量和成分有明显变化，表明AQP4、AQP5在粘膜下腺液体分泌中有重要作用，调节AQP4、AQP5的活性，可改变肺部疾患的腺体分泌.本实验结果显示：臭氧攻击后，气道高反应过程中，大鼠肺组织AQP4、AQP5的表达水平均较正常时降低.这与国外研究的博莱霉素肺损伤模型或腺病毒感染模型引起的水通道蛋白减低的结果类似”.分析其原因可能为臭氧连续吸入，攻击了正常气道上皮组织，致使上皮受损，出现气道上皮失稳态，随后气道应激，分泌炎症介质、细胞因子等增加，进一步加重气道损伤，引起上皮细胞的脱落和破坏，气道基底层和粘膜下腺细胞膜暴露失去保护，使AQP4、AQP5表达下调。值得注意的是，本实验还提示，气道高反应过程中，AQP4、AQP5表达出现下降，粘蛋白MUC5B表达增高，粘液总量增多，经糖皮质激素治疗后，AQP4、AQP5的表达较气道高反应时有所增加，MUC5B的表达和粘液分泌量较气道高反应时有所减少.提示AQPs(AQP4、AQP5)的表达与粘液分泌量呈现负相关的趋势;AQPs(AQP4、AQP5)的表达与MUC5B的表达呈现负相关的趋势.作者分析认为气道高反应时，气道炎症加重、多种炎症介质释放增加，使杯状细胞和纤毛上皮比例失衡，而AQP4、AQP5的表达下降又引发了肺水在肺泡和毛细血管间的转运障碍，最终导致水清除障碍、粘液高分泌，糖皮质激素极有可能通过减少炎症介质释放，抑制气道炎症，促进气道上皮的修复，间接导致AQP4、AQP5的表达增多，从而加快肺泡内液体的清除，粘液分泌减少，肺组织的水肿程度减轻，气道高反应陛得到有效缓解.
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