摘要:为了确诊秦皇岛市昌黎县某肉牛养殖场肉牛肺炎的病因，试验对肉牛肺脏中的病原进行分离培养，并对纯化培养的分离菌采取革兰氏染色、细菌生化鉴定及16SrDNA鉴定，对分离菌进行药敏试验和小鼠致病性试验。结果表明:从病死牛严重病变的肺脏实质部分离到一株优势菌，为革兰氏阴性杆菌。生化试验结果表明，该优势菌与铜绿假单胞菌符合率高达99.9%，将该分离菌命名为PaQHD-1。16SrDNA鉴定结果表明，PaQHD-1与铜绿假单胞菌参考菌株处于同一分支，并且同源性在99%以上。PaQHD-1仅对环丙沙星表现敏感，对其余的14种抗生素均表现耐药;分离菌可致小鼠死亡，小鼠死亡率100%(5/5)。说明本次致牛肺炎的病原为铜绿假单胞菌，且该分离菌具有一定的致病性及耐药性。
关键词:牛;肺炎;铜绿假单胞菌;分离鉴定;耐药性
呼吸系统疾病在肉牛养殖过程中较为常见，是制约肉牛养殖业健康发展的重要因素。牛肺炎通常是由病原感染引起的呼吸系统疾病，临床常见症状有咳嗽、鼻漏、体温升高等[1-2]。导致肺炎的病原有多种，包括细菌、病毒、支原体、真菌和寄生虫等，其中细菌所致肺炎较为普遍[3]。常见的致病菌有肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、巴氏杆菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌和铜绿假单胞菌等。2019年10月份，昌黎县某肉牛养殖场养殖的7头肉牛发病，临床症状为咳嗽、气喘、流脓性鼻涕、食欲废绝等，经抗生素治疗无效后死亡1头牛。剖检病死牛发现其肺脏有不同程度的红色肉变，并有浓烈的异味。为确定该肉牛养殖场肉牛发病原因，笔者对送检样品进行细菌的分离鉴定，以及耐药性试验和致病性试验，以期对该病的治疗提供指导。
1材料
1.1病料
病死牛肺脏，昌黎县某肉牛养殖场提供。
1.2试验动物
昆明小鼠10只，体重为(20±5)g，购自北京维通利华实验动物有限公司。
1.3主要试剂
哥伦比亚血琼脂培养基(羊血)，购自广州迪景微生物科技有限公司;革兰氏染色液，购自北京博奥拓达科技有限公司;药敏纸片，购自杭州天和微生物试剂有限公司;ID32E肠杆菌科及其他非苛养革兰氏阴性杆菌鉴定试剂条，均购自法国梅里埃公司;DL-2000Marker，购自中科瑞泰科技有限公司;2×TaqMasterMix、细菌DNA基因组提取试剂盒，均购自康为世纪生物科技有限公司。
2方法
2.1发病牛临床症状及剖检
向送样养殖户询问并记录发病情况，剖检病死牛肺脏，无菌采集病料并保存。
2.2细菌的分离鉴定
用接种环挑取送检牛肺脏病变组织，接种于绵羊血琼脂培养基，置于37℃恒温培养箱培养12h。挑取优势菌落进行纯化培养及革兰氏染色，染色后在显微镜下观察。
2.3分离菌的生化鉴定
用ID32E试剂条对分离菌进行生化鉴定，操作按照试剂条说明书进行，并用ATB自动生化鉴定系统判定试验结果。
2.416SrDNA鉴定
参照参考文献[4]合成16SrDNA通用引物，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。用细菌DNA基因组提取试剂盒提取分离菌的DNA，并以其为模板进行PCR扩增。PCR扩增体系(50μL)为:2×TaqMasterMix25μL，上、下游引物各1μL，模板1μL，ddH2O22μL。PCR扩增程序为:94℃预变性5min;94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s，共30个循环;72℃终延伸10min。PCR结束后将PCR产物送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，测序结果在NCBI的BLAST分区进行检索，并下载细菌参考序列用Lasergene软件的MegAlign程序建立进化树并进行同源性分析。
2.5药敏试验
参照美国临床和实验室标准协会(ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute，CLSI)的K-B纸片法检测分离菌对15种抗生素的敏感性，试验结果按照CLSI标准进行判定并统计。
2.6致病性试验
参照参考文献[5]中的方法进行试验。将分离菌接种于LB液体培养基中，在37℃恒温摇床培养12h，离心后弃上清液，用无菌PBS重悬菌体并调整菌液浓度为1×107cfu/mL。试验组小鼠5只，每只腹腔注射0.1mL调整后的菌液;对照组小鼠5只，注射0.1mL无菌的PBS。持续观察小鼠1周，记录小鼠发病及死亡情况，分离死亡小鼠肺脏、肝脏等器官细菌并鉴定。
3结果与分析
3.1临床症状及剖检变化
患病牛8月龄，体重约500kg，气喘，流脓性、黏性鼻涕，咳嗽，精神沉郁，食欲废绝。用氟苯尼考等抗生素类药物治疗无效，1周后死亡。剖检可见肺脏大部分呈暗红色(见165页彩图1)，且有明显异味。3.2分离菌培养特性及革兰氏染色从病死牛严重病变的肺脏实质部分离到一株优势菌，该菌用血琼脂培养基培养，出现α溶血，菌落较大，表面光滑湿润，形态不规则，呈淡绿色，见165页彩图2，并且产生类似葡萄气味。革兰氏染色结果显示，分离菌为革兰氏阴性杆菌，见165页彩图3。
3.3生化鉴定
结果见表1。
由表1可知，分离菌株的d-葡萄糖、酯酶、丙二酸盐、L-天冬氨酸芳胺酶、精氨酸双水解酶、尿素酶试验结果均为阳性，其余生化试验结果均为阴性。ATB自动生化鉴定系统判定牛肺脏分离到的优势菌为铜绿假单胞菌，符合率高达99.9%，初步判定分离菌为铜绿假单胞菌，并命名为PaQHD-1。
3.416SrDNA鉴定
分离菌16SrDNA的PCR产物测序结果用NCBI的BLAST分区检索，建立系统发育进化树并进行同源性分析，结果见图4。
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由图4可知:PaQHD-1与铜绿假单胞菌参考菌株处于同一分支，并且同源性在99%以上;与假单胞菌属的荧光假单胞菌处于同一个大分支，与其他大肠杆菌、沙门氏杆菌、巴氏杆菌和链球菌等亲缘性相对较远，进一步验证了分离菌为铜绿假单胞菌。
3.5药敏试验
结果见表2。
由表2可知，PaQHD-1仅对环丙沙星敏感，对其余14种抗生素表现耐药。PaQHD-1具有严重的多重耐药性。
3.6致病性试验
分离菌感染小鼠12h后，小鼠精神沉郁，呼吸深而沉，对外界刺激反应能力降低;24h后小鼠全部死亡，剖检发现腹腔及胸腔有恶臭味并有积液，肝脏、肺脏、脾脏有出血症状，肺脏出血最为严重。对照组小鼠无死亡，精神状态良好。试验组小鼠内脏均分离到感染的绿脓杆菌。
4讨论
铜绿假单胞菌又称绿脓杆菌，广泛存在于自然界中，是一种条件致病菌[6]。该菌可感染多种动物发病，如牛、貂、马肺炎，奶牛乳房炎和子宫炎等，并常与大肠杆菌、葡萄球菌等其他致病菌造成混合感染[7]。本研究从患有肺炎的病死牛肺部病变区分离到一株优势菌，经培养特性、细菌16SrDNA及生化鉴定试验鉴定为铜绿假单胞菌，并命名为PaQHD-1。
目前，国内已有报道从奶牛、水貂、袋鼠、獭兔、林麝等动物中分离到致病铜绿假单胞菌，并以小白鼠为致病性试验的动物模型研究分离菌的毒力，发现均具有较强的致病性[5，8-11]。参考上述试验方法验证PaQHD-1的致病性，发现感染该分离菌的小鼠全部死亡，且以呼吸道症状为主，剖检病死小鼠发现肺脏病变严重，说明PaQHD-1具有致病性，初步判定铜绿假单胞菌感染是导致该牛场肉牛发病原因。
临床在治疗细菌感染引起的疾病时，通常采用抗生素进行治疗[12]。铜绿假单胞菌是一种人畜共患菌，该菌对多种抗生素具有天然耐药性，由于近年来抗生素类药物的滥用致使该菌的耐药种类逐年增加[13]。据报道，2016—2018年清镇市第一人民医院铜绿假单胞菌多重耐药性呈上升趋势[14]。铜绿假单胞菌耐药种类的增加给人医和兽医临床治疗该菌所致疾病带来困难。本次分离的PaQHD-1菌株仅对环丙沙星表现为敏感，对试验的其余7类14种抗生素表现耐药，表明该分离菌株具有多重耐药性。张耀相等[8]分离的奶牛铜绿假单胞菌对氟哌酸、氧氟沙星、先锋必等抗生素高度敏感。相比于张耀相等[8]分离的奶牛铜绿假单胞菌分离株，本次分离的菌株耐药情况更为严重，表明不同地区不同来源的致病性铜绿假单胞菌耐药情况不同，临床治疗时应注意根据致病菌株的药敏试验结果合理制订给药方案，避免抗生素类药物的滥用及延误治疗时机。
本次从昌黎县某肉牛养殖场患有肺炎的病死牛肺部分离到一株铜绿假单胞菌，经试验验证该分离菌株具有一定的毒力，并且耐药情况十分严重。——论文作者：刘勃兴，赵安奇，康圆圆，滕文萍，吴同垒，史秋梅*，张志强*
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